产品目录

本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解膜组分，提取过程简单方便，适用于从各种动物血小板中提取总蛋白。本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用百奥莱博其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用蛋白脱盐柱脱盐处理。

• 使用方便，蛋白提取的时间约1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 有效期为试剂盒未拆封前按要求条件保存的有效期，试剂拆封后请尽快使用完。

• 仪器准备：离心机、振荡器、涡旋混匀器、移液器、冰箱、冰盒；
  
• 试剂准备：Tyrode's solution/CGS缓冲液/生理盐水/PBS等、蛋白定量试剂盒；
  
• 耗材准备：离心管、吸头、一次性手套。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 以下血小板收集方法仅供参考。有条件时可以使用全自动血小板分离机分离血小板，可以使用凝胶过滤法收集，降低活化程度。也可使用实验室常用的方法或者根据文献选择方法。
  
• 血小板蛋白回收率大约70～80%。

• 取1～5mL ACD抗凝血，室温200×g离心10分钟。
  
  • 离心力在180～220×g均可，不要大于250×g。
    
  • 最好用尽可能新鲜的血样。
• 收集上层血浆，弃下层血液细胞沉淀层。
  
  • 如果血浆层与红细胞层之间形成白膜，小心吸取白膜层加入上层血浆。
• 将上层血浆层室温200×g离心5分钟。
  
  • 此步骤选做，可以不做。
    
  • 对血小板蛋白纯度要求高时选做。
• 上层血浆室温3000×g离心10分钟。
  
  • 如果对血小板低活化程度要求较高，血小板需要进行再培养等处理，此步骤离心力可以降低到2000×g，离心时间缩短至5分钟。
    
  • 降低离心力和缩短离心时间会降低蛋白回收率。
• 弃上清，沉淀中加入500μL血小板洗涤液B洗涤一次，3000×g离心10分钟。
  
  • 此洗涤液可能会抑制血小板活化速度，如果下游在蛋白提取前需要进行血小板培养等其他实验处理的话，请根据需要使用。
    
  • 可以不用本试剂盒所配的稀释液洗涤血小板，使用常规的台氏缓冲液、CGS缓冲液、生理盐水、HBSS、PBS等均可。建议使用改良台氏液或CGS缓冲液。
    
  • 如果对血小板低活化程度要求较高，血小板需要进行再培养等处理，此步骤离心力可以降低到2000×g，离心时间缩短至5分钟。
• 弃上清，沉淀中加入200～500μL冷的蛋白提取液A和2μL蛋白酶抑制剂混合物，吹打混匀后，在4℃条件下振荡20分钟。
  
  • 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体有轻微晃动即可。
    
  • 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间即可，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 蛋白样品用于测定某些蛋白酶活性等下游实验时，注意根据实际情况决定抑制剂混合物是否加入。
• 在4℃，12000～16000×g条件下离心15分钟。
  
• 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到血小板蛋白。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  
  • 建议用BCA法进行蛋白定量。
    
  • 蛋白样品－80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长蛋白提取液的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为蛋白提取液中含有干扰Bradford法的组分，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组分，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。